在实验中的应用

溃疡性结肠炎临床治疗存在药物副作用大、疗效有限等问题，马齿苋作为药食同源植物具有良好抗炎潜力，其水提物成分复杂，需按分子量精准分级。

本研究采用山东博纳生物科技集团有限公司生产的 BONA-GM-18有机膜分离实验机，对马齿苋水提物进行分级处理，得到不同分子量组分，并从中分离制备马齿苋多糖。

经膜分离后，高效富集大分子多糖组分，为后续活性验证与机制研究提供稳定样品，明确马齿苋多糖可通过调节氧化应激、修复肠道屏障、重塑菌群及调控B细胞分化缓解溃疡性结肠炎，为天然抗炎活性成分开发提供设备与工艺支撑。

膜过滤优势

可按分子量对马齿苋水提物实现快速分级，高效富集目标多糖组分，分离过程温和且无交叉污染，保证活性成分结构完整。

纯物理常温过滤操作，不添加有机溶剂，最大程度保留马齿苋多糖与小分子物质的抗炎、抗氧化活性，产品安全性高。

设备运行稳定，适配植物水提液体系，可有效减轻膜污染，保持通量稳定，大幅缩短活性成分分离纯化周期。

工艺简洁可控，批次重复性好，能耗低、无残留，可直接从实验室小试放大至工业化生产，适配天然植物活性成分的规模化制备。

参考文献

《马齿苋对 DSS 诱导的溃疡性结肠炎的缓解作用及其机制研究》

宁可

吉林大学

摘要

溃疡性结肠炎（ulcerative colitis,UC）,是炎症性肠病（inflammatory bowel disease,IBD）的一种,发病部位多发生在乙状结肠和直肠,严重时会发展至整个结直肠部位。随着人们生活环境、饮食结构和其他因素的变化,在全球范围内,UC患者数量在快速的增加。而现阶段针对UC的临床治疗药物上还存在缺陷（药物副作用和治疗效果受限等）,这使得一些患者最后不得不接受手术治疗。因此,对天然安全的UC药物开发具有重要意义。马齿苋（Portulaca oleracea L.）是石竹目、马齿苋科一年生草本植物,在中国作为食品或药品被使用已经有千年的历史。其具有抗炎、抗氧化、降血糖、降血脂和止痢等多种药理作用。然而,马齿苋水提物对UC的作用报道较少,而且未能清楚解析水提物中的有效成分的组成和对UC的缓解机制。 在本研究中,首先使用膜分离系统获得不同分子量区间的马齿苋水提物,并使用化学试剂显色法和液相色谱-质谱（liquid chromatography-mass spectrometry,LC/MS）解析物质组成的差异,结合葡聚糖硫酸钠（dextran sulfate sodium,DSS）诱导的溃疡性结肠炎小鼠模型探究不同分子量区间的马齿苋水提物的缓解作用及作用差异。依据水提物的实验结果,推测多糖在UC治疗中具有较强的优势和潜力,于是从马齿苋水提物中分离获得马齿苋多糖（Portulaca oleracea L.polysaccharides,POP）,采用凝胶渗透色谱、高效液相色谱、扫描电子显微镜及傅里叶变换红外光谱及体外抗氧化能力对多糖进行表征。采用UC小鼠模型,探究POP对UC的缓解效果。最后,结合转录组与微生物组分析,进一步探究了POP缓解UC的机制。主要研究结果如下: 1.马齿苋水提物不同组分的成分特点研究。根据分子量大小,使用膜分离系统,分离得到四个组分,即马齿苋提取物大分子（Portulaca oleracea L.extract macromolecule,POEM,分子量>10 k Da）、3–10 k Da组分、1–3 k Da组分和马齿苋提取物小分子（Portulaca oleracea L.extract small molecule,POES,分子量<1k Da）。对成分分析发现,POEM中含有更高比例的多糖和蛋白,POES中则富含有更多种类的有机酸和生物碱。比较发现,其他两组分的物质占比低于1%,并且LC/MS检测出的物质成分种类大多被POES与POEM涵盖。在体外抗氧化的实验中,POEM与POES也表现出更突出的效果。通过扫描电镜观察POEM与POES的微观结构,结果发现POEM的表面更加紧实,而POES含有较多孔洞。 2.POEM与POES对UC小鼠的改善作用探究。动物实验分为5组,分别是对照组（CON）、模型组（DSS）、马齿苋水提物大分子组（POEM,400 mg/kg/day）、马齿苋水提物小分子组（POES,400 mg/kg/day）和阳性药物组（SASP,200mg/kg/day）。除CON组外,其余各组在饮用水中添加4%DSS构建UC模型,研究水提物对UC的缓解效果。结果发现,POEM与POES都可以减少由于DSS导致的结肠缩短和体重降低;提高体内抗氧化酶（超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）、过氧化氢酶（catalase,CAT）和谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase,GSH-px）的活性;减少肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）和白介素（interleukins,IL）-6的含量;增加IL-10的含量;维持肠道完整性,减少黏蛋白损失,恢复紧密连接蛋白的表达;调节肠道菌群和增加结肠内容物中短链脂肪酸（short-chain fatty acids,SCFAs）的含量。但是,结果发现,POEM与POES通过不同方式缓解UC。除了抗炎和调节抗氧化能力外,POEM与肠道菌群作用更紧密,通过重塑肠道菌群缓解UC,而POES主要作用在抗炎和抗氧化能力上。 3.马齿苋多糖的提取和表征。因为POEM干预后SCFAs的增多以及微生物组结果的分析,并结合POEM的成分特点,使得研究聚焦到马齿苋多糖。利用热水浸提,乙醇沉淀及Sevag法除蛋白后,从膜系统分离后的马齿苋水提物中提取得到一种分子量为2.65×10～4Da,主要包含半乳糖、阿拉伯糖、半乳糖醛酸和葡萄糖的马齿苋多糖。通过傅里叶变换红外光谱检测,证明POP中含有3279 cm-1、2936 cm-1、1738 cm-1和1607 cm-1处的特定吸收峰。此外,通过对扫描电镜结果的分析,发现POP的微观结构表面是较为完整光滑的。抗氧化实验结果表明,根据2,2′-联氮双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二铵盐(2,2′-Azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid）,diammonium salt,ABTS)清除能力实验计算的IC50,每mg POP相当于20.92±1.92μg维生素E（vitamin E,VE）。铁离子还原能力（ferric reducing antioxidant power,FRAP）结果显示,每mg POP相当于5.15±0.89μg VE。 4.POP缓解UC的能力及机制探究。动物实验分为5组,分别是对照组（CON）、模型组（DSS）、马齿苋多糖低剂量组（POPL,400 mg/kg/day）、马齿苋多糖高剂量组（POPH,800 mg/kg/day）和阳性药物组（SASP,200 mg/kg/day）。除CON组外,其余各组在饮用水中添加4%DSS。研究结果显示,POP可以减少由于DSS导致的结肠缩短和体重降低等UC模型的典型病理症状;调节体内氧化应激,增加抗氧化酶（SOD、CAT和GSH-px）的活性;减少促炎因子TNF-α和IL-6,增加抗炎因子IL-10;维持肠道完整性,减少黏蛋白损失,恢复紧密连接蛋白的表达。POP可以调节肠道菌群,尤其是高剂量的干预使得其门水平聚类与CON组更接近。POPH的干预显著富集了肠道有益菌属如:Clostridia＿UCG＿014、Paraprevotella、Lachnospiraceae＿NK4A136＿group、Prevotellaceae＿UCG＿001、Rikenellaceae＿RC9＿gut＿group、Oscillibacter和Romboutsia。此外,POP增加结肠内容物中短链脂肪酸的含量。通过转录组分析了小鼠结肠样本的转录状况,结果显示,POP下调了视黄醇代谢的相关转录,增加了B细胞增殖分化的转录。通过高效液相色谱法对粪便中视黄醇含量检测,发现POP可以提高视黄醇的含量。逆转录实时定量聚合酶链式反应（reverse-transcription quantitative real-time polymerase chain reaction,RT-q PCR）及免疫荧光的结果也都证实了POP影响了B细胞的增殖分化,如:增加CD19的m RNA及蛋白表达,增加Ms4a1,Cr2,Cd22,Fcer2a和Cd37（B细胞特定时期的表面标志物）的m RNA表达。同时,POP干预降低了炎性浆细胞标志物CD138的表达,增加了免疫球蛋白A（immunoglobulin A,Ig A）的表达。结果显示,POP调节了宿主的肠道稳态缓解UC。 综上所述,本研究中以马齿苋为研究对象,从马齿苋水提物中得到不同的组分,结合物质组成的特点,分析其在UC缓解能力的差异。本研究中还从马齿苋中提取获得一种马齿苋多糖,证实了POP对UC的改善效果。结合肠道微生物组学和转录组学的结果解析证实了POP对B细胞增殖分化的影响和可以重塑肠道稳态的能力。本篇研究补充了马齿苋作为营养/功能食品开发的理论依据,为以后更多类似的药食同源的植物的有效成分研发和功能探究提供思路。

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